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siGENOME SMARTpoolライブラリーを用いたゲノムワイドsiRNAスクリーニング
〜ArrayScanを用いたキナーゼ活性解析の応用〜

東京大学薬学系研究科 細胞情報学教室 名黒 功

【要旨】
 生体が様々なストレスに応答するシステムとして、MAPキナーゼ経路をはじめとしたタンパク質リン酸化を介する細胞内情報伝達が非常に重要な役割を果たしていることが明らかになって久しい。これまでリン酸化シグナル伝達研究はウェスタンブロットなど細胞集団のアウトプットを対象とした研究が主流であった。一方で個々の細胞を対象に細胞の形態など空間的情報を残したままリン酸化シグナルを解析できる手法として、リン酸化特異的抗体による細胞免疫染色などの技術が発展してきている。
 細胞免疫染色の解析では、個々の細胞の形態、タンパク発現量、細胞周期のステージなど個性を把握することが可能で、タンパクの空間的局在や、集団の平均値の解析からは得られない細胞間のバラツキなど多くの情報を取得できる。しかし、これらのデータの解釈は個人の顕微鏡観察によるところが大きく、統計的解析を適用できるような量的データに変換することが難しいため、客観性という点で改善すべき問題がある。
 最近、我々は浸透圧ストレスに応答するASK3というキナーゼについて、蛍光細胞免疫染色による高感度な活性検出系を構築した。さらに、この染色画像の取得と解析を自動イメージアナライザArrayScanで行うことにより、個々の細胞を解析対象としながら、十分統計的解析に耐える例数の取得と、客観的なクライテリアに基づくデータ解析を可能にした。これらの技術により、ASK3の浸透圧ストレス依存的なキナーゼ活性変化を信頼性高く1細胞レベルで解析できるようになり、ウェスタンブロットでは原理的に解析不可能であった細胞のストレス応答性について新たな知見が明らかになってきている。
 この測定系は解析を自動化したことから非常にハイスループットにキナーゼ活性を数値化し、客観的な比較が可能であるという大規模スクリーニングに適した性質を有している。そこで、浸透圧ストレス時にASK3のキナーゼ活性変化に関わる上流因子を網羅的に探索する目的で、ゲノムワイドのsiRNAスクリーニングを現在行っている。1次スクリーニングでは約18,000遺伝子のsiRNAライブラリーとしてsiGENOME SMARTpoolライブラリーを使用した。今回の発表では、実際にスクリーニングを行った系の説明とその結果をもとに、使用したsiRNAライブラリーの利点や問題点、さらにはArrayScanを用いてRNAiスクリーニングを行うメリットなどについて紹介し、議論したい。
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